7.军团病诊断标准及处理原则.pdf

C 59 中华人民共和国卫生行业标准 wS 195-2001 军团病诊断标准及处理原则 Diagnostic criteria and principles of management of legionnaires disease 2002一01一01实施 2001一07一20发布 会 ｝} 中华人民共和国卫生部 发布 WS 195-2001 前 军团病（legionnaires disease）是由军团菌属（legionella)、主要是嗜肺军团菌（legionella pneumophila）引起的一种细菌性呼吸道传染病。本病在全球普遍存在。我国已有小规模爆发及散发病例。由于军 团菌肺炎与其他肺炎不易区别，且老年人容易受到侵犯，一旦患病，病情相当严重。如治疗不当，其病死 率可高达15%-2O％。为了对军团病患者提供可靠的诊断，进行合适的治疗，结合我国军团病防治工作 现状，特制定本标准。 本标准附录A中A2、A3、A4.附录B中B3、B4、B5、B6及附录C的诊断方法为参考诊断方法。 本标准由卫生部疾病控制司提出。 本标准负责起草单位；中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所；参加起草单位：协和医院。 本标准主要起草人：万超群、朱元班、陆慰营。 本标准由卫生部委托传染病防治监督管理办公室负责解释。 中华人民共和国卫生行业标准 军团病诊断标准及处理原则 WS 195-2001 Diagnostic criteria and principles of management of legionnaires disease 参照《中华人民共和国传染病防治法》及《中华人民共和国传染病防治法实施办法》制定本标准。 范围 本标准规定了军团病的诊断标准及处理原则。 本标准适用于各级、各类型医疗保健、卫生防疫机构和人员对军团病病例的诊断和处理。 2 诊断原则 2. 1 应根据流行病学资料及临床表现和常规实验室检验结果进行综合分析 2. 2 确诊需依据病人双份血清军团菌抗体恢复期较急性期增高4倍或味上或军团菌培养阳性。 3 诊断标准 3. 1 流行病学史 全年均可发病，多数发生在夏秋季节。中老年病例较为多见。有慢性肺病病史者、免疫功能低下者、 器官移植者、建筑工地施工人员、近两周内的旅行者以及吸烟者较易感。如发现两例或以上的成组病例， 应当进行血清流行病学调查。同时对可疑军团病患者的标本，如痰、血液、胸水、支气管肺泡灌洗液进行 军团菌的分离培养，还可从外环境如宾馆、医院、电影院等的空调系统冷却塔水、淋浴水、湖水、井水、池 水以及地表面污水中分离军团菌。 3. 2 临床表现 临床上可以有两种类型：非肺炎型(pontiac fever）和肺炎型。 3.2.1 非肺炎型 临床表现类似感冒，症状：发热、咳嗽、头痛、肌痛和胸痛，但无肺炎。病程3-1O天，可自愈。 3.2. 2 肺炎型 亚急性起病，症状：发热、头痛、寒颤、咳嗽或痰中带血，胸痛和肌痛，部分病人有恶心、呕吐、腹泻、相 对缓脉，有些患者尤其是儿童，可出现精神神经症状如澹妄、幻觉甚至昏迷等，重症病人可发生急性肾功 能衰竭、休克，或因菌血症产生的肺外器官感染。x线胸片显示肺有浸润性阴影，部分有胸腔积液，重症 病人有肺脓肿甚至空洞。 3.3 常规实验室检查 多数血沉加快，血白细胞计数增高，部分有中性白细胞核左移，可能有乳酸脱氢酶、血清谷草转氨 酶、胆红素升高或有蛋白尿、低钠血症和低磷血症，血尿并不多见，但镜检时尿中可有红细胞。痰或气管 内抽吸物作革兰染色和一般培养。军团菌为革兰阴性杆菌，但初代分离菌革兰染色着色不明显，而且培 养的阳性率很低。 3. 4 特异性实验室检查（参见附录A、附录B、附录C) 3.4.1 军团菌培养 中华人民共和国卫生部2001一07-20批准 2002-01一01实施 wS 195-2001 以痰、支气管抽吸物、支气管肺泡灌洗液或胸水为标本，在含N- 2一乙酞氨基一2-氨基乙烷磺酸 (ACES)的酵母浸膏培养基（BCYE）中培养军团菌。 3.4.2 细菌抗原检测 采用直接荧光抗体法（DFA), 3.4-3 血清特异性抗体检测 采用间接荧光抗体法(IFA)、试管凝集试验(TA）等方法检测军团菌特异性抗体。起病时及3-8周 后两次血清军团菌抗体滴度呈4倍或以上增长，单次抗体大于1:256(IFA)，或凝集抗体从1,40呈4 倍或以上增长或一次凝集滴度为1:320 (TA）者，可确定有军团菌感染。 曰口口口．...，、‘ 3.5 病例分类 -4户尸 一 ，气‘ 3.5. 1 临床晰 满足3. 1、3. 2、3. 3加3.J阅。 -4户尸 ，，勺‘ 阅饭 网饭 阅瓜 月V J尸 3.5.2 确诊病例 满足3. 1、3. 2.3.创枷3.J两 或3.4.2. 录 4 处理原则（参见， 霉素、阿奇霉素 4. 2 早期发 4- 3 如发现 菌污染的水源 处理。对可疑 可疑病人五 使用，复方 衅韶瀚乍选 性叫的 羚 种向 附群 媳山衅川 功 卜洲感 量避免使用糖乡 幻 助加 J 翻L艘皮 4. 1 早期发现 幼能衰 实验室检查以 兹属盛星、强力 勺刃、 0 骗翻蠕 纂黔 者可选用红 L有效。应尽 , 毓篙粼 防 测 对被军团 进行消毒 WS 195-2001 附 录 A （标准的附录） 军团病病原学诊断方法 Al 直接荧光抗体染色检查法 本法操作简便，能快速发现各种被检病理标本中是否存在军团菌。但当标本中军团菌数量较少或病 原菌为荧光抗血清未包括的新种（型）时，结果常为阴性，故阴性结果不能排除军团病。 Al. 1 荧光抗体制备 Al. 1.1 用1％甲醛盐水自固体培养基上洗下军团菌菌苔，4 C过夜杀菌，pH7. 2操作PBS洗2次，配 制成4X109/mL菌细胞的菌液。 A1.l.2 免疫前自家兔取血，用作对照血清，采取皮内注射法或静脉注射法免疫家兔。如凝集反应效价 达到1:5 12。以上可以全放血，并分离血清。 Al.1.3 免疫前兔血清与抗军团菌血清用50%.33％饱和度硫酸按提取羊球蛋白，调整蛋白浓度为20 mg/mL。按常法用异硫氰酸荧光素（FITC）标记。 A1.2 标本制备 Al. 2.1 肺组织；新鲜组织可制成印片或研磨成10％悬液后涂膜，于空气中千燥后加热固定，再在涂膜 上滴加10％中性甲醛固定10 mm。吸弃甲醛后用蒸馏水轻轻漂洗，干燥后镜检。如为甲醛固定组织，可 用刀片切成组织块，造成新的组织面，用刀片呈直角在组织上刮取细微的组织颗粒糊，于载玻片上涂膜， 干燥后加热固定。 Al. 2.2 其他标本：痰、支气管灌洗液或抽出物、胸水（应注意抗凝）可选取粘性部分（胸水等也可离心 取沉淀物）涂膜，干燥后加热固定。10％中性甲醛固定10 mm，蒸馏水漂洗，干燥后染色镜检。可疑培养 物：用接种环挑取可疑菌落，混悬于1％甲醛等渗盐水中，涂膜，干燥，加热固定。 Al.3 染色方法 A1.3.1 荧光抗体工作溶液配制：将标准军团菌株用PBS制成悬液后涂片，使每高倍视野菌数50。一 600条，用不同稀释度的荧光抗体染色。凡出现3+---4+荧光强度的最高稀释度为1个效价单位(3+: 菌细胞发明亮的黄绿色荧光；4十：菌细胞发耀眼的黄绿色荧光）。常规工作中用2个效价单位作为工作 溶液。 Al.3.2 操作：每份标本在同一张载片上作两个涂膜。一个用免疫前兔7一球蛋白荧光素标记物染色，作 阴性对照；另一用荧光抗体染色。置37C湿盒中温育30 miii后用PBS洗去多余的荧光血清（洗时载片 加有荧光抗体的一侧向下），并用PBS浸洗2次（每次5 mm),蒸馏水冲洗1次，干燥，涂膜滴加pH9. 0 缓冲甘油，盖玻片封固，荧光显微镜检查。 Al.4 结果的解释：痰胸水、气管抽吸物或灌洗液等标本，每张涂膜上只要发现5条以上染色鲜明、形 态典型的军团菌，即可报告阳性。其他临床标本，每张涂片发现有）25条强烈发荧光的细菌，报告为阳 性，1一 24条为可疑,0条为阴性。 A2 军团菌多重聚合酶链反应（MPCR）和产物检测（参考） A2. 1 寡核昔酸引物的合成 由中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所军团病课题组设计的一对引物，用以扩增嗜肺军 团菌，可产生206bp的产物（mip基因片段）。另一对引物为扩增1 6SrRNA用。不仅可检测嗜肺军团菌 种，而且可以检测某些非嗜肺军团菌种。 wS 195-2001 A2.2 扩增程序 在容积为0. 5 mL的Eppendorf离心管中加人（100 tL): 1/10体积 lox PCR缓冲液 200 imo1/L dNTPs 2units Taq酶 0.2 ;imol/L 引物（l、2)(mip) 0.05 imol/L 引物（3、4)(l6SrRNA) 模板DNA（可用至2 ,-tg，取决于靶序列含量） 加灭菌三蒸水至最终体积100 iL,易异脚牌尸尸翎， 月户尸 一‘曰．........ 对照各一份。 A厂 月尸尸 A2.3 循环参数 首次循环 正式循环 油。试验分别设立阳性对照和阴性 61'C 72 C 455 455 455 455 循环次数 末次循刘 起酚蓝电 取扩增产 凝胶，于0. 5X 待检材料（痰、 异性DNA带 俩 （3f 嘟 气 A2.4 结果 凝胶中出 特异性DNA: 粼 进行电童 吁别为 叮 一〕 bp)J 戳 上，如重 验后未 灌洗液、 即阳‘} 攀团菌感 bp）及。86 属基对I 恃异性D卜 有特异性｛ r纂团菌感 I PCR )NA月 的琼脂糖 察结果。 ）〕或一条 ！阴性。如 现两条特 A3 协同凝集词盼（ 此法原理是和哪 的特异性抗体（IgG习 可溶性抗原的检样或 砖性，将军团菌 蒸黔 - SPA ________ j zI1.NttSP lgG Fc 标本（含军团菌 但操作方便，可 qJ 勺J qJ AA 供参考。 1 试剂 飞、 ，，、 1 4睿SPA弋金黄色葡蠢巍 ｛月．。SPA A 接种于固体培养基或液体培养基。固 体培养基：蛋白陈（或脉陈)lOg,葡萄糖1 g,氯化钠3g，磷酸氢二钠（Na2HPO4 ・ 12H20)2 g,琼脂25 g, 牛肉汤1 000 mL，用氢氧化钠溶液调pH至7.4,121'C 20mm高压灭菌，倾注平皿。液体培养基：(T：培 养基）：胰蛋白陈(trypticase)5 g，半胧氨酸100 mg,酵母浸膏37.5 mL，葡萄糖5 g,氯化钠3. 75 g，蒸馏 水500 mL，调pH至7.4,115'C 30mm灭菌。葡萄球菌 Cowan 1株以接种液体培养基为好，在固体培养 基上生长者易发生菌体自凝。 A3.1.1.2 37C培养24 h后，用0. 01 mol/L pH7. 4 PBS自固体培养基上洗下菌苔，3 000 r/min离心 20 mm（如在液体培养基中培养，则直接离心）。弃取上清，沉淀用PBS洗2次，再用含0. 5％甲醛的PBS 配成io%(V/V)悬液，于室温放置3h或过夜。然后置80C水浴15 mmn（时时摇动），取出后迅速冷却， 用PBS洗3次，再用含10 gIL NaN。的PBS配成10% (V/V)悬液。4℃保存可用半年。用前离心，弃上 清，用PBS洗1次。 A3. 1. 2 致敏SPA菌液（抗体一葡萄球菌复合物）：取上述10% SPA菌稳定液1 mL，加军团菌种或型 特异性抗血清0. 1 mL,混匀于室温反应30 mm，时时摇动。反应完毕，用PBS洗2次，沉淀悬于含 wS 195-2001 1. 0 gIL NaN。的PBS 10 mL中，制成1％悬液（或2%)。分装，4C保存，可用半年左右。 A3. 2 试验方法与结果判定 试验在载玻片上进行。取致敏SPA菌液1滴，加标本（如为尿标本可沸水浴5 mm，离心去沉淀。必 要时可用分子量6000的聚乙二醇浓缩10-50倍。如为待鉴定的细菌培养物，可制成10亿菌／mL，然后 100 C水浴15 min),1滴（尿）或内径5 mm接种环一满环（菌液）。充分摇匀，在8W日光灯上方观察结 果。判断标准为： 4十：菌体凝成大块，液体透明。 3+：菌体凝成大颗粒，液体透明。 "+：菌体凝成较大颗替液礴鉴 1+：菌体凝成小颗粒，液告视蚀。 或J翻腻 后才有细小颗粒。 一：无颗粒形成 一般以）2＋为 将菌液100 C 加 异性类属抗原所 A4 乳胶凝集 ；油疚可以避免嗜肺军团菌，博杰曼军团菌和熟撇入刃菌等鞭毛上的非特 卿严叉协同凝集反乌 验F考．........ 车在1:100稀 将市售聚苯乙筛胶乳（polystyrene latex)颗粒(0. 8拜 m）用蒸馏水配制 释时于650 urn吸光度达0. 355。取1份胶乳贮存液加抗军 pH8。甘氨顾缓忡液配制的牛血清白蛋白（200 jig/rnL)混2 IgG (1骨拼g/, ）科 归0. 1 mol/L 充分摇匀数分 ,37 再 加人I％牛血清白蛋白2份，37 C水浴30 mmn。于4C 18000g离心10 mmn。沉淀用 1% 白 洗1次，再悬人1份牛血清白蛋白中，加叠氮钠（NaN3）至0. 04% ,4 C保存。对照胶箕试齐 免 IgG同法制备。衣 立尿标本沸水浴5 mm，以减少非特异凝集，离心除去沉淀 *于票 技璃 滴 「于180次／mm震荡器-II C动洲 0 mmn。肉眼观 1滴，充分混匀，在防止哥 致敏乳胶和M标 魁可溶性抗原。 此法检测尿中嗜肺军团 察，以）＋为 仄J 'd A A 细菌分离培 仄 J ' J 眨J A A A A ):；军；辈罩洪滤(ACES 7.0; 州 50 mL 'J 500 mL 形瓶 ，混合后分装到两个锥形 C 20mm（同时高压一小瓶蒸馏水和两个 1.4 每个锥形瓶再加人10 g 琼脂 3 称10 g酵母浸膏加入 滤器，两支注射器）; A5. 1. 5 分别称0. 4 g焦磷酸铁和0. 6 g L一半肤氨酸盐酸盐，置于两个平皿中； A5.1.6 待培养基温度降至约60 C时，将灭菌蒸馏水溶解的焦磷酸铁和半肤氨酸，通过滤膜 (0. 22 im）过滤除菌，等量加到两个锥形瓶中； A5.1.7 倒人平皿，每个约20 mL,覆盖整个平皿底部。 A5.2 痰液直接培养法 A5.2.1 试剂配制 A5.2.1.1 酸中和试剂的配制 A:。．2 mol/L氯化钾溶液（14. 9 g几） B: 0.2mol/L盐酸（17.2 ml/L) 18份A和1份B混合pH2. 0 A5.2.1.2 碱中和试剂的配制 WS 195-2001 C:0. 1 mol/L氢氧化钾溶液（6.46 gIL) AA 仄J 哎J 只口 A 取C 10. 7 rnL十89.3 mL蒸馏水PHI 3 2.2 步骤 2.2.1 取少量病人痰液至试管中，加1 mL酸中和剂，混匀，静置10 mm; 2.2.2 加人1 mL碱中和剂，混匀，静置10 mm。离心沉淀，吸取少量沉淀物到BCYE培养基（平 皿）上划线接种。35C烛缸中孵育。观察7天，如发现可疑菌苔，进一步进行鉴定。 附 录 B （标准的附录） 军团病的血清学诊断方法 Wi 间接荧光抗体染色法 B1.1 试验用液 B1.1.1 稀释液：稀释菌液、血清及荧光抗体用 0. 01 mol/L PBS pH7. 6 氯化钠 8. 0 g 磷酸氢二钠 2. 99 磷酸二氢钾 0. 2 g 1 000 mL 蒸馏水 B1.2 实验步骤 B1.2.1 抗原片：抗原片用酒精棉球擦拭后，用稀释液将菌液稀释10倍，使之成为10亿／rnL，然后滴人 抗原片孔中，待自然干燥后，用丙酮固定30 mm; B1.2.2 取反应板递倍稀释待检血清，1: 8-'l: 512，分别滴加到抗原片中，留两孔作为对照，置湿盒 中，37' C孵育lh; B1.2.3 洗涤3次，每次3 mmn，不断摇动； 81.2.4 用稀释液按1:8稀释荧光抗体，加入每孔，置湿盒中，37'C 1 h; B1.2.5 洗涤，同上。 Bl.2.6 结果判断： 4十：菌细胞发出耀眼的黄绿色荧光； 3十：菌细胞发出明亮的黄绿色荧光； +：荧光清晰，但较3十弱； +：荧光较弱，刚可辨认； 一：菌细胞不发荧光。 82 试管凝集试验 B2. 1 将洁净无菌处理的试管整齐摆放于试管架上，每一血清型5管，另设阴性对照（抗原对照） 82.2 在第一管中加人经高压灭菌的生理盐水0.9 mL，其余各加0.5 mL，阳性对照管加人0.5 mL适 当稀释的兔抗军团菌血清； B2. 3 在第一管中加人0. 1 ml一待检血清，倍比稀释。 B2. 4 将浓缩的凝集抗原（制备方法同Bi)用经高压灭菌的生理盐水稀释到终浓度为10亿／mL，各管 分别加人稀释后凝集抗原0.5 mL，其最终凝集反应滴度为1: 20-1: 320,35-37C反应过夜，次日观 察结果。 6 ws 195-2001 B2.5 结果判定： 4十：上清完全透明，菌体于管底呈伞状沉淀，摇荡时沉淀物产生絮片及颗粒(100%凝集） 3十：上清几乎完全透明，有同样的沉淀，当摇荡时产生絮片及颗粒（75%凝集）; 2+：上清稍为透明，有同样的沉淀，当摇荡时产生絮片及颗粒(50％凝集）; 1+：液体有勉强的透明度，底部有不大的扇状沉淀； 一：液体均匀混浊，底部无扇状沉淀。 B2. 6 标准：凝集度为“＋十”的血清最大稀释度为血清效价。 B2. 7 单份血清抗体效价1次大于等于1:320或双份血清抗体效价从1:40呈4倍或以上增长者可 诊断为该血清型军团菌抗体阳性。 月口口口．.．勺、‘ B3 微t凝集试验（参考） B3.：实验用液：稀 澎 磷 磷 氯蒸 0. 067 mo1 瓦 P pH6. 4 二HPO4 ・ 12H20) 酸氢 酸J 口民．L 了 水法 一 划卜 口卜r．巨 置置 孔 孔 泽 盒由 歹7 验 劝川科 夕 实 B 目．叹d 月！ ,L qJ 月 ，乙 gL Q乙 勺乙 9一 八艺 勺O 勺J ,J 乃0 qJ CO 月 仔 月 马 月『 B B B B B B B 每孔加 最后月口翻 作阴性对照，（抗原对U? 4倍增高者有貂断愈义 观察梦 L 鉴 ISA 包 碳 碳 蒸 B 缓冲液 被液：碳习端之缓钧掖(pH9. 6) 酸钠（无水） 酸氢钠 馏水 2. 93 口口口口 1 000 . B4. 1 .2 稀释液：磷酸盐缓冲液（pH7. 4Y , 8. 0 g 氯化钠 磷酸氢二钠（Na2HPO4 ・ 1 2H20) 2. 9 g 0. 2 g 磷酸二氢钾 1 000 mL 蒸馏水 B4. 1.3 洗涤液：上液加人0. 5 mL吐温-20; B4.1.4 底物缓冲液：(pH5. 0) 19. 2 gIL 甲液：C6H807（无水） 乙液：Na2HPO4 ・ 12H20 71. 6 g/L 甲液 24. 3 mL，乙液25.7 mL,蒸馏水50 mL，混合即得pH5. 0磷酸拘椽酸缓冲液100 m L. B4. 1.5 邻苯二胺底物配制： 100 mL 磷酸拘椽酸缓冲液(pH5. 0) 40mg 邻苯二胺 WS 195-2001 30％过氧化氢溶液 0. 15 mL B4.2 操作方法 B4.2.1 包被：用包被液1:100倍稀释可溶性抗原（按常规方法制备），酶标板各孔加入稀释过的包被 液100拼 L,4'C冰箱过夜； B4.2.2 洗涤：3次，每次3 mm; B4.2.3 封闭：用含1％小牛血清白蛋白稀释或1％白明胶稀释液，37C ,30 mm; B4.2.4 洗涤同上，加待检血清100 iL／孔，血清从1,10倍比稀释至1,2 560，最后一孔为阴性对照， 每批实验中，每型设一排阳性血清对照和正常兔血清对照。 B4.2.5 洗涤，加酶结合物100 jiL／孔，37C,1 h. B4. 2. 6 洗涤，加邻苯二胺底物液100 jiL／孔，37C,15 mm，每孔加人50 gL,2 mol/L硫酸溶液终止 反应。 B4.2.7 结果判定：A=495 nm测OD值 A镇。．2 质控标准：阴性对照 阳性血清在）1:320稀释度 A)0. 3 正常兔血清在＜1:320稀释度A<0. 3 待检血清i1)0. 3为该份血清军团菌抗体最终滴度，单份血清滴度）-I:320或双份血清抗体滴度 有4倍增高者，有诊断意义。 只 〕 B B 权d ｝ 卜｝ B Dot-EL-ISA方法检测军团菌抗体（参考） 溶液的配制 1 .1 PBS一吐温(pH7. 4) 磷酸二氢钠（NaH2PO4 ・ 12H20) 2.9g 磷酸氢二钾 0.2g 氯化钠 蒸馏水 8. 0 g 1 000 mL 吐温20 0.5mL B5. 1.2 10 mmol/L TBS Tris 1. 21 g 氯化钠 9. 09 浓盐酸 0. 5 mL 勺d 步骤 按需要取适当大小的硝酸纤维素膜，用尺子划上小方格； 〕 户0 7I n匕 仄 亡 」 gLOL 气 U 匀 L 咬〕 gL 乙勺 O' 亡 J 气U 9一 月．.gL qd 月峪 反 d 获口 只 U jl nZ O' 9L 叹〕 B B B B B B B B B B 1 000 mL 蒸馏水 封闭液：用100 mmol/L TBS稀释脱脂牛奶，使浓度为50 g/L, 点膜：将标准可溶性抗原，相当于20亿／mL（浊度）点于小格内，每格2 tiL，自然风干 封闭：用封闭液封闭30 mm; 倒掉封闭液，加待测血清，血清也用封闭液稀释，置摇床上，室温振荡2h; 吸出血清稀释液，用PBS一吐温洗3次，每次1 mm; 加酶标羊抗人IgG结合物反应，室温摇床振荡2 h,酶也用封闭液稀释； 洗涤：用PBS一吐温洗2次，100 mmol/L TBS洗1次。 显色液： 4-氯-1一苯胺 12mg 冷乙醇(-20C保存） 4 mL wS 195-2001 20 mL 100 mrnol/L TBS 12 1iL 30％过氧化氢溶液 B5. 3 结果：显色20 mm，显色时也在室温下振荡20 mm，有颜色且为实心者，滴度达到1: 320为阳 性，每次实验时均设阳性和阴性对照。 B6 间接血凝试验（参考） B6. 1 军团菌可溶性抗原制备 军团菌抗原结构复杂，用溶菌酶和DNA酶消化，乙酸锉和EDTA提取及DEAE纤维素柱与 Sepharose 6B柱层析等方法，自嗜肺军团菌血清1型（Knoxville 1株）和血清2型(Togus 1株）分离出 型特异和型共同性的两种抗原。型特异性抗原是一种脂蛋白一碳水化合物的复合物，电泳时有4条区带。 如用pH7. 0 PBS自琼脂培养基上洗下嗜肺军团菌血清1型(Philadeiphial株）的菌苔，15 000 g离心 20 mm，上清用滤膜过滤，冻干，与兔抗血清或人恢复期血清作琼脂双相扩散试验，至少可出现3条沉淀 线。经Sepharose 6B柱分离，可形成两个主峰。其中第一峰含35％的碳水化合物，2. 6％蛋白，1.8％磷 脂和1%2-酮-3一脱氧辛酸盐是间接荧光抗体试验和微量凝集试验的靶抗原，有型特异性，分子量 >4X iO道尔顿。用免疫酶标记技术证实存在于菌细胞表面。间接血凝试验所用的可溶性抗原，系用 PBS浸取的粗制抗原。制备方法如下： B6. 1. 1 用灭菌的0. 01 mol/L pH7. 2 PBS自BCYE琼脂培养基上洗下菌苔，于Arnold灭菌器内 101℃处理lh（或沸水浴1 h)，离心弃上清； B5.1.2 用灭菌PBS洗沉积的菌细胞2次； B6. 1. 3 按每0.1 mL沉淀菌细胞加灭菌PBS 2 m工J，制成细菌悬液。于4C置10天，经常摇动； B6. 1. 4 3 500 r/rnin离心20 miii，上清即为可溶性抗原。 116.2 致敏绵羊红细胞 取20％甲醛、丙酮醛醛化红细胞悬液0. 1 mL（绵羊红细胞双醛化法，见“注”),1 500 r/min离心 5 mm，弃上清，加人用0. 2 mol/L pH4.。乙酸一乙酸钠缓冲液稀释的军团菌可溶性抗原lmL（稀释度通 过方阵滴定法预试选定），混匀。37℃水浴lh致敏。用PBS洗3次后，以含1 gIL明胶、0. 4 g/L牛血清 白蛋白、0. 5%(V/V）羊细胞膜的pH 7. 2. 0. 1 1 mol/LPB（稀释液）配成0.7%悬液。 B6. 3 操作与结果解释 于V型46孔微量血凝反应板上按常法进行，待检血清用稀释液自1:2起作连续双倍稀释至 1:4 096。试管排各孔补加稀释液1滴，阻断试验排各孔加最适稀释度抗原1滴，然后各孔均加致敏红 细胞1滴。各孔总量为0. 075 mL，混匀I mm，置37 C湿盒1-2 h后观察结果。以50%(2+）凝集为终 点。阻断试验排出现血凝抑制应）2孔。每批试验应以相应的兔抗军团菌抗血清作阳性对照，其血凝效 价变化不应＞2孔。如双份血清抗体效价明显增高者，可考虑军团菌感染。 注：双醛化绵羊红细胞(SRBC）的制备 1．将SRBC用10-20倍容积0. 11 mol/L pH 7.2 PB洗5次，再用此PB配成8％悬液； 2．缓慢加人等容积丙酮醛、甲醛混合液（丙酮醛15 mL，甲醛3 mL,0. 11 mol/L pH 7.2 PB 60 mL，用100 gIL氢氧 化钠溶液调pH至7. 2，再补加PB至100 mL)，室温缓慢搅拌17h,1 500 r/min离心20 mmn，弃上清，沉积细胞用 PB洗3次，并配成20%悬液，加叠氮钠（NaN3）至1 g/L.4C保存备用。 附 录 C （标准的附录） 军团病分子生物学诊断方法（参考） 用地高辛标记的特异性军团菌DNA探针进行核酸杂交检查，全过程包括探针标记、靶DNA的制 9 ws 195-2001 备、膜结合、杂交和显色5个步骤。 Cl 地高辛（DIG）标记DNA探针 cl.l 特异性DNA片段的获得：PCR或全染色体酶切（取特定分子量片段）。 C1.2 DNA片段的纯化和回收：低溶点琼脂糖凝胶纯化法或透析袋纯化法，经酚／三氯甲烷抽提，乙醇 沉淀。 C1.3 DNA片段的DIG标记：（随机引物法） 将完全变性的DNA片段加进微型离心管内（置于冰浴中），分别加入 2 iL 六核昔酸混合物 2 iL dNTP标记混合物 再加入适量灭菌三蒸水调溶液体积为19 gL,短暂离心，最后加人1 iL Kienow酶，混匀，37 C孵育 lh以上，也可过夜。用EDTA终止反应。 C1.4 探针的标记效果检测：(Dot blot反向杂交法） 将已制备好的探针100' C沸水浴变性5 mm，立即置于冰水浴中5 mm以上。取少量(1川J左右）点 于硝酸纤维素膜上，80CC固定后，直接进人结果检测过程。 靶DNA的制备 C2 C2. 1 C2. 2 细菌培养：军团菌BCYE培基，35℃烛缸培养48 h; DNA提取：SDS裂解，酚／三氯甲烷抽提法。 C3 DNA结合于硝酸纤维素膜上 C3. 1 Southern blot：电泳结束后，琼脂糖凝胶变性60 miri(变性液：0. 6 mol/L氯化钠溶液0. 2 mol/L 氢氧化钠溶液），蒸馏水漂洗1 miii；中和60 min(中和液：0.15 mol/L Tris-HCI pH 7.6,1.5 mol/L氯化 钠溶液），弃中和液转膜。 C3. 2 Dot blot：将DNA样品在沸水浴中变性10 mm，迅速放于冰水中，用微量加样器将样品加到硝酸 纤维膜上，晾干后80℃固定2h。以三蒸水或己知无特异DNA片段的样本作为阴性对照。 C4 探针与靶DNA杂交 D4.1 预杂交：将转移好的硝酸纤维素膜装人大小相仿的塑料袋内，加人预杂交液，封口，68 C预杂交 lh以上，晃动。 C4. 2 杂交：去预杂交液，加人杂交液（含Dig-i i-dUTP标记探针，其余成分同预杂交液）,70C保温6h 以上（杂交条件取决于探针和靶DNA)。洗去未杂交的探针：2XSSC,1. 0 g/L SDS 100 mL,5 minX2, 室温;0. 1XSSC,1. 0 g/L SDS 100 mL,70C ,15 minX2。洗膜时置摇床上摇动。 C5 杂交结果的检测 C5. 1 地高辛抗体结合：先将杂交膜在缓冲液I中室温洗1 mm，换缓冲液11 (100 mL）室温洗膜 30 mm，倾去液体，加人20 mL抗体液（含抗体地高辛150 u/mL,缓冲液II）浸泡3. mmn，室温。 C5. 2 显色：用缓冲液I 100 mL洗膜，15 minX2，去除未结合的抗体；换缓冲液1 20 mL平衡膜 2 mm。将膜装人塑料袋内，加人10 niL显色液，封膜，避光数分钟至24 h，及时观察，到显色满意时，用 50 mL缓冲液Iv洗膜终止反应。 C6 结果判定：当硝酸纤维素膜上出现有蓝色条带（Southern blot，大小与琼脂糖凝胶中DNA条带相 仿）或蓝色圆点（Dot blot)，即为检测结果阳性，同时，阴性对照应无染色。 部分试剂的配制 Ito WS 195-2001 20/ssc: 氯化钠 Na3 ・ C6H507 ・ 2H20 175. 3 g 88. 2 g 10 mol/L 氢氧化钠调pH值到7. 0，加蒸馏水至1 000 mL0 50 >< Denhart: 聚蔗糖（Ficoll 400) 聚乙烯毗咯烷酮(PVP) 牛血清白蛋白（BSA) 1g 1g ig 100 mL 蒸馏水 溶解后，微孔滤膜过滤灭菌，10 mL分装，一20' C贮存备用。 预杂交液： 50XDenhart 5. 0 mL 2OXSSC 7.5m1 lOOg/LSDS 0.5mL 蒸馏水 缓冲液I: 100 rnmol/L Tris-HCI 37.0 mL pH7. 5 150 mmol/L氯化钠 缓冲液l: 封闭液(10%) 缓冲液I 缓冲液l: 100 mmol/L Tris-HC1 10 mL 9OmL pI{9. 5 100 mmol/L氯化钠溶液 50 mmol/L氯化镁溶液 缓冲液N: 10 mmol/L Tris-HCI 1 mrnol/L EDTA pH8. 0 显色液：（现配） 45 jiL 35 tL 10 mL NBT BCIP 缓冲液111 附 录 D （标准的附录） 军团病治疗原则 月．1 D D 非肺炎型 D 闷1 ， 弓，. 1 对症治疗 2 病原治疗 口服红霉素1---2. 0 g／日或阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素、环丙沙星、四环素、磺胺甲异嗯哇与甲节 胺嗜陡等。 L00闪―的6一 wS 195-2001 D2 肺炎型 D2.1 一般治疗 卧床休息，流质饮食，有失水者可静脉补液，保持尿密度＜1. 020，血钠＜145 mmol/L，补充足够热 量、蛋白质和维生素。观察呼吸、心率、血压及尿量。注意可能发生的急性肾功能衰竭、休克等。 D2.2 高热、头痛、呕吐、腹泻等分别给予对症处理，有明显胸痛、肌痛可给少量止痛剂。氧分压(Po2) <8. 0 kPa或紫给者应给吸氧，腹泻可用止泻剂如黄连素，烦躁不安、澹妄可用安定或水合氯醛，不用抑 制呼吸的镇静剂。 D2. 3 病原治疗 可选用以下药物：红霉素1--2. 0 g／日，甚至3. 0 g／日口服或静滴；阿齐霉素0. 25----0. 5 g／日口服或 静滴；克拉霉素0.25 g口服2次／日或500 mg静滴每12 h 1次；环丙沙星或氧氟沙星200-400 mg每 8 h--12 h一次口服或静滴；利福平0. 45-0. 6 g／日口服，一般肺炎使用10-28天，对免疫功能低下或 胸片显示病变广泛者，疗程至少3周。尽可能联合用药，如大环内酷类抗生素或氟哇诺酮药与利福平一 并使用。四环素、罗红霉素、磺胺甲基异嗯哩与甲节胺嗜陡也有效。而青霉素、p一内酞胺类和氨基糖贰类 抗生素治疗无效。 D2.4 并发急性肾功能衰竭时的治疗 D2.4. 1 调节水、电解质和酸碱平衡。 D2.4.2 控制氮质储留。 D2.4.3 供给足够营养。 D2. 5 并发休克时的治疗 D2. 5. 1 给低分子右旋糖醉或平衡盐液，补充血容量，酸中毒可用碳酸氢钠。 D2.5.2 用多巴胺或异丙基肾上腺素等血管活性物质，使收缩压维持在12-1I3. 3 kPa左右。当休克并 发肾功能衰竭时可用利尿剂，合并心力衰竭时可酌用强心剂。 版权专有 侵权必究 书号：155066 ・ 2-14307 WS 195-2001 定价： 18.00元